1922年8月刘湛恩回国，在南京东南大学执教。不久来到上海，受聘担任中华基督教青年会全国协会教育总干事。他还兼任上海职业指导所主任及大夏大学等校教育学教授。

　　1928年1月，沪江大学校董会慕名聘请刘湛恩担任沪江大学第一任中国籍校长，这时刘湛恩年仅32岁，是中国近代最年轻的大学校长之一。他就任后致力革新校务，并倡导“积极的、前进的、建设的、牺牲的”沪江精神，强调师生团结、民主、进步、学术自由。刘湛恩对学校进行了卓有成效的整顿和改革：他向国内外募款增建校舍；添置图书、仪器设备；聘请专家、学者来校任教；修改过时的规章制度；积极支持男女同学制；倡导开明、活泼的学风；号召学生毕业后到农村去、到边疆去建设祖国；严格执行宗教课的选修和不计学分的规定，建立从幼稚园到高中的一整套教学实验体系；扩充分别设在附近农村和工厂区的社会服务中心。同时，极力改善学生的生活条件和教职工的福利，大力开展体育及其他课外活动。于是，沪江大学的面貌为之一新，吸引了不少远道慕名而来的广东、福建学生以及菲律宾、南洋和夏威夷的华侨学生。

　　1932年他四处奔走筹集资金，购买了圆明园路浸礼会真光大楼作为校舍，创办了沪江大学城中区商学院，利用晚上时间上课，成为我国办得较早的一所新型夜大学。沪东公社也是他举办职业教育和文化补习学校的实验园地，公社为沪江大学附近工厂的职工创造学习文化的条件，为沪东地区培养了不少工人干部。

　　1931年，日本帝国主义发动了“九一八”事变，他在多种场合大声疾呼，要救亡图存。在出国考察和参加国际会议期间，向国际友人、海外侨胞揭露日寇的侵华暴行，呼吁侨胞大力支持祖国的抗日斗争。1932年，沪淞“一八”事变发生，他积极参加上海各界人民抗敌后援会的工作，支持十九路军抗日。1933年7月至1934年3月，他应邀访美，向美国20多个城市和大学介绍中国局势，揭露和控诉日本的侵华罪行，呼吁侨胞团结、支援国内的反侵略斗争。1935年，北平爆发“一二九”学生爱国运动，第二天，刘湛恩和上海文化界马相伯、沈钧儒、周建人、陶行知、邹韬奋等283人联合发表了《上海文化界救国运动宣言》，呼吁全国人民团结起来，救亡图存。

　　1937年，日军悍然发动了“七七”芦沟桥事变和“八一三”事变，中国的抗日战争全面爆发，刘湛恩把全校师生员工和家属安全转移到市区沪江大学城中区商学院大楼复课。他除了主持沪江大学校务外，还统筹负责因受战火殃及而迁入市区的圣约翰、之江、东吴三所教会大学组成的“联合大学”校务。同时他被推选为上海各界救亡协会理事、上海各大学抗日联合会负责人、中国基督教难民救济委员会主席、国际红十字会副会长。他全力以赴地开展慰劳伤兵、救济难民、安抚流亡学生等工作，获得国际红十字会的赞扬。

　　1937年11月12日，日军攻占上海。12月，日本侵略者占领南京，制造了骇人听闻的“南京大屠杀”。当时在南京的一些外国记者和教会人士，亲眼目睹这一幕幕的悲惨情景，偷偷地拍下了许多惨不忍睹的照片，转寄给刘湛恩，请他设法保存和发表。刘湛恩冒着生命危险，保存下了这批反映日本法西斯暴行的珍贵历史资料。

　　1938年初，卖国汉奸准备在南京成立伪“中华民国维新政府”，内定出任伪行政院长的温宗尧到上海游说刘湛恩，请他出任伪教育部长，当场遭到刘的严辞拒绝。利诱不成，随之而来的是日寇、汉奸连续不断的威胁和恫吓，刘家多次收到内藏子弹的恐吓信和接到一些来历不明的人打来的辱骂和恫吓电话。面对这一切，刘湛恩毫不畏惧，泰然处之。上海的亲朋好友劝他早日离沪，免遭不测，都遭到他的婉拒。他曾说过：“为了真理和正义，即使上十字架也在所不辞。”

　　1938年4月，国际救济协会委派刘湛恩到国外募捐，他在中国旅行社预订了4月13日去香港的船票。报纸上披露了这一消息，引起了敌人极大的恐慌，于是，日本特务组织所操纵的汉奸帮会布置了罪恶的暗杀计划。1938年4月7日晨，刘湛恩在静安寺路、大华路口（今南京西路、南汇路口）的车站候车时，突遭三名日伪特务的枪击，当场壮烈牺牲，时年42岁。